气候变化是世界各国所面对的巨大挑战，而减少全球经济对石油的依赖将大大减缓气候变化的步伐。农业和生物技术的进步，促进了可替代某些化石燃料的乙醇和生物柴油的大规模生产。尽管这些生物燃料优势明显，但仍然无法应用在海陆空长途运输、重型机械运作以及火箭领域，这些领域需要高功率和高能量重量比的石油衍生碳氢化合物作为高能燃料。这些化合物由于富含具有张力键角的环状分子，可比非环状分子储存更多的能量，因此很难被非石油来源的化合物所替代。例如，在航空领域中采用的环状烷烃类燃料，其分子结构中C-C键形成非109.5°的夹角，而键的张力会导致燃料的净燃烧热增加。其中，具有最大张力和最高燃烧热的环丙烷分子键角为60°。不过，通过有机化学法去合成环丙烷类化合物难度极高且成本高昂，还涉及源自石油的有毒有害中间产物。
近日，美国国家工程院院士、劳伦斯伯克利国家实验室的Jay D. Keasling教授带领的研究团队设计聚环丙烷化分子用作高能燃料，并且在细菌中合成了聚环丙烷化脂肪酸甲酯（polycyclopropanated fatty acid methyl ester, POP-FAME）生物燃料，能量密度大于 50 MJ/L，超过目前应用较广的火箭和航空燃料。为了生产这种高能生物燃料，他们鉴定了一种能够形成聚环丙烷化脂肪酸（POP-FA）的迭代型聚酮合酶（iterative polyketide synthase, iPKS）（图1），随后通过异源表达系统获得POP-FA，对其分子结构进行鉴定并命名为燃料霉素（fuelimycin）。接下来，他们通过改造异源表达系统增加燃料霉素的产量，获得POP-FAME，并计算其燃烧焓、能量密度（作为净热值）和蒸气压，数据表明POP-FAME有望取代HTPB等固体火箭推进剂。此外，燃料霉素生物合成途径具备生产多种高能量密度生物燃料的潜力。相关工作发表于Cell Press旗下期刊Joule。
图1. 基于iPKS的聚环丙烷化天然产物的生物合成。（A）通过 iPKS 逐步环丙烷化的生物合成机制。（B）本研究中涉及的一种合成火箭燃料Syntin、已知的聚环丙烷化天然产物和燃料霉素。ACP：酰基载体蛋白；AT：酰基转移酶；KS：酮合酶；KR：酮还原酶；DH：脱水酶；CP：环丙烷化酶；AmT：转氨酶；TE：硫酯酶；NADPH：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；SAM：S-腺苷甲硫氨酸。
为了鉴定能够生产POP-FAs的候选iPKS，在7,762个细菌基因组组成的数据库中，研究者利用Jawsamycin生物合成途径的 Jaw4 和 Jaw5 的氨基酸序列进行系统基因组检索。检索到19 个候选iPKS，最终选择来自Streptomyces albireticuli NRRL B1670 中的iPKS（图2）。该通路包括4个基因，将其命名为pop1-4。
图2. 形成POP-FA的iPKS的生信预测。（A）本文表征的S. albireticuli NRRL B1670中POP-FA生物合成基因簇（pop BGC）的遗传结构。（B）S. albireticuli NRRL B1670 中pop BGC的基因注释。（C）pop BGC的分布、同源性和多样性。
研究者首先通过培养S. albireticuli NRRL B1670来鉴定pop1-4的产物，并分析其脂肪酸含量，然而并未发现任何环丙烷化分子。分析原因可能为 iPKS在实验条件下未表达，此外，S. albireticuli NRRL B1670遗传不稳定，已发现其基因组的自发丢失高达1.5 MB。因此，他们以大肠杆菌作为宿主，尝试异源表达和体外合成途径重构。但由于蛋白表达量低，并未实现POP-FA的合成。而以Streptomyces coelicolor M1152 作为宿主表达重构的pop1-4操纵子，成功合成POP-FA。结合核磁共振和质谱，他们对该途径的4个主要产物结构进行了鉴定（图3）。
图3. 燃料霉素的分子结构分析。（从左到右）依次为燃料霉素 D、C、B、A质谱数据（负离子模式）。（A）提取离子色谱图。（B）观察到和预测的离子。（C）同位素分析与13C标记基团引入对应的质量偏移。
他们对先前报道的有利于聚酮化合物合成的改造策略进行了验证，工程化改造合成途径后的重组菌株产量可提高 22 倍（图4）。
图4. 不同菌株或合成途径改造策略对燃料霉素合成的影响。（A）稀有 TTA 密码子的影响。（B）组合改造的影响。（C）菌株 POP3.2的不同改造策略。
接下来，研究者制备了POP-FAs的甲基酯，即POP-FAME，并计算POP-FAME和其他潜在POP途径衍生分子的能量密度。分析表明POP-FAME和其他POP燃料的能量密度达到50 MJ/L，优于其他生物燃料，并且已经接近目前使用的化石火箭燃料（图5）。
图5. POP-FAME和可再生以及不可再生燃料的能量密度。不同 POP途径衍生分子结构和通过净热值计算的能量密度如图所示。燃料霉素衍生的POP-FAME（红色突出显示）的能量密度与合成的不可再生火箭燃料 JP-10 和 RJ5接近。
小结
Jay D. Keasling教授团队在细菌中合成聚环丙烷化脂肪酸甲酯作为新型高能生物燃料，能量密度大于 50 MJ/L，超过目前火箭航空领域应用较广的合成燃料。该工作表明，完全可能基于生物法获得可替代高耗能领域化石燃料的生物燃料。下一步的研究重点是实现规模化合成，以早日进行商业生产。
Biosynthesis of polycyclopropanated high energy biofuels
Pablo Cruz-Morales, Kevin Yin, Alexander Landera, John R. Cort, Robert P. Young, Jennifer E. Kyle, Robert Bertrand, Anthony T. Iavarone, Suneil Acharya, Aidan Cowan, Yan Chen, Jennifer W. Gin, Corinne D. Scown, Christopher J. Petzold, Carolina Araujo-Barcelos, Eric Sundstrom, Anthe George, Yuzhong Liu, Sarah Klass, Alberto A. Nava, Jay D. Keasling*
Joule, 2022, DOI: 10.1016/j.joule.2022.05.011
第一作者
Pablo Cruz-Morales
Pablo Cruz-Morales是联合生物能源研究所（JBEI）的博士后，合作导师Jay D. Keasling 教授。主要研究方向为结合系统基因组学和合成生物学挖掘和设计天然产物。他在墨西哥先进基因组学机构 (UGA-CINVESTAV) 获得植物生物技术博士学位。2021 年他加入丹麦诺和诺德基金会生物可持续发展中心，与 Keasling 教授共同指导酵母天然产物实验室。该实验室致力于利用真菌异源表达系统生物合成分子。
通讯作者
Jay D. Keasling
Jay D. Keasling，美国国家工程院院士，作为工程微生物和代谢调控的先驱，担任加州大学伯克利分校化学工程和生物工程教授，联合生物能源研究所首席执行官。Keasling教授在内布拉斯加大学林肯分校获得学士学位，在密歇根大学获得博士学位，并在斯坦福大学进行博士后研究。Keasling 教授发表了多篇研究论文，引用累积超过 60,000 次，主要研究基于微生物法合成药品、商业化学品以及生物燃料。
